Artikel

Investigasi virus dengan Atomic Force Microscopy

Investigasi Virus dengan Atomic Force Microscopy

Wabah virus Covid-19 memberikan dampak pandemik global yang cukup mencenangkan. Pelbagai cara dilakukan untuk investigasi virus tersebut. Salah satunya menggunakan Atomic Force Microscopy (AFM).

Mengenal lebih dekat Atomic Force Microscopy?

Kemajuan Atomic Force Microscopy berawal pada tahun 1990 menghasilkan imaging sampel biologis dalam cairan melalui resolusi nanometer.

Sejak saat itu, AFM dinobatkan mampu menghilangkan mikroskop electron sebagai satu-satunya alat untuk penyelidikan virus.

Hal ini dikarenakan, banyaknya perdebatan di kalangan peneliti jika keberadaan patogen kecil yang terlihat secara miskrokopis memiliki tanggung jawab atas pelbagai penyakit pada makhluk hidup.

Misalnya, virus Covid-19 yang bertanggung jawab atas lebih dari 6 juta kematian, puluhan juta kehilangan pekerjaan, dan kerugian ekonomi.

Pun, adanya potensi lain yang dimiliki Atomic Force Microscopy (AFM) dalam investigasi berbagai jenis virus, yaitu.

  • Kemampuan mengukur sifat mekanik virus
  • Melihat interaksi adhesi sel dan sifat listrik (electrical properties).

High-resolution imaging viruses

Atomic Force Microscopy memiliki kemampuan untuk memvisualisasi virion individu dalam lingkungan liquid sehingga membuatnya sangat menarik.

Pertimbangan terbesar yang relevan untuk teknik imaging AFM apapun adalah imobilisasi sampel yang tepat.

High resolution imaging Atomic Force Microscopy
Fig 1. High-resolution imaging of genetically modified tomato bushy stunt virus capsids.

Kapsid virus yang saling mendukung menciptakan resolusi imaging yang stabil dan lebih tinggi. Proses imaging dilakukan dalam larutan buffer dengan mode QI.

(A) Height image (range: 30 nm), (B) Young’s modulus map (range: 3 Gpa), (C) Tip-sample adhesion map (range: 2Nn).

Umumnya, virus berbentuk bulat atau silindris dengan tinggi hingga sekitar puluhan hingga ratusan nm. Lemahnya imobilisasi diiringi dengan kekuatan imaging yang tinggi atau kecepatan pemindaian dapat dengan mudah menyebabkan pelepasan virus dari permukaan.

Cluster atau kristal virus 2D (gambar 1) ditunjukkan oleh virion individu saling mendukung dan gerakan lateral yang terbatas menjadikannya dapat lebih mudah tercapainya proses imaging dan resolusi yang lebih tinggi.

Hal ini dikarenakan, struktur gliko/lipo protein, virion dapat diisolasi pada permukaan datar dengan protokol standar untuk imobilisasi molekul (2,3) kemudian melapisi permukaannya dengan molekul adhesi untuk proses perlekatan (misalnya poli-L-lisin).

Permukaan hidrofobik layaknya grafit pirolitik yang berorientasi (HOPG) atau kaca silanisasi dilaporkan dapat melumpuhkan virus herpes simpleks (HSV)-1.

Sebagian virus berukuran >20 -50nm, substrat datar atomik tidak diperlukan untuk imaging karenanya kaca biasa dapat digunakan. Akan tetapi, pada beberapa analisis menunjukkan bahwa kaca dapat berbeda dengan mika dan HOPG.

Sebab itu, dapat menginduksi pembongkaran kapsid dan pelepasan DNA. Kemampuan beroperasi pada suhu yang berbeda mengakibatkan pengguna Atomic Force Microscopy dapat mempelajari suhu yang menyebabkan degradasi virus.

Penelitian milik Sharma et al menunjukkan suhu yang sedikit meningkat 34°C dapat dengan cepat menyebabkan degradasi dramatis partikel mirip virus SARS Cov-2 baik dalam kondisi basah ataupun kering.

fig 2 high resolution imaging of herpes simplex virus bruker
Fig 2. High-resolution imaging of the herpes simplex virus capsid.

Kapsid virus tunggal diimobilisasi pada kaca silanisasi dan dianalisis dalam larutan buffer menggunakan mode PeakForce Tapping dan probe Bruker PEAKFORCE-HIRS-F-B.

Skala tinggi 110 nm (gambar kiri) dan 50 nm (gambar kanan). Kapsomer individu terlihat jelas.

(Prof. A. Evilevitch, Univ. Illinois di Urbana-Champaign, AS)

Bruker bangga menjadi penemu mode yang telah merevolusi pencitraan resolusi tinggi dalam liquid: mode Tapping (1994), mode PeakForce Tapping (PFT) (2010), dan mode Quantitative Imaging (QI) (2011).

Tidak hanya imaging beresolusi tinggi dalam liquid tetapi juga membuatnya mudah digunakan, terlepas dari pengalaman AFM. Gambar beresolusi tinggi pertama dari virion SARS-CoV-2 menular asli diperoleh menggunakan mode QI [6].

Imaging virus uptake and release

Virus tidak dapat berfungsi dan berkembang biak sendiri. Sebab itu, membutuhkan organisme inang, seperti bakteri, ragi, tumbuhan, dan sel mamalia.

Atomic Force Microscopy dapat dengan mudah memvisualisasikan semua hal tersebut dalam kondisi fisiologis asli, dengan resolusi hingga 50 – 100 nm pada sampel hidup dan 20 – 50 nm pada spesimen tetap.

AFM dapat memvisualisasi proses pengambilan dan pelepasan virus secara in vitro.

Hal ini dikarenakan, penyesuaian kecil saat imaging sel mamalia lunak dengan AFM dimungkinkan untuk memvisualisasi salah satu struktur permukaan sel dengan menerapkan tekanan yang lebih kuat untuk melihat sitoskeleton dan struktur lain di bawah membran plasma (Fig. .3 A, E).

Live cell imaging with Atomic Force Microscopy
Fig. 3: Live cell imaging using AFM.
  1. (A) Imaging Low-force PFT untuk visualisasi mikrovili pada permukaan sel MDCK
  2. (B) Imaging High force PFT visualisasi struktur di bawah membran sel (misalnya sitoskeleton) pada sel MC3T3 (sampel: Simone Weigel, IBG KIT, Karlsruhe, Jerman)
  3. (C) Real Height (gambar pada zero force dari gambar (B) dihitung dalam Analisis NanoScope
  4. (D) Topografi sel Vero diimaging menggunakan mode Ql pada 300 pN dan direkonstruksi pada 0 pN
3D Atomic Force Microscopy image of vero cell
Fig. 4: A three-dimensional AFM image of a Vero cell infected with the severe acute respiratory syndrome (SARS)–associated coronavirus

Virus intraseluler banyak yang terlihat tepat di bawah membran plasma (ditunjukkan oleh tanda panah). Pertikel virus yang diekstrusi hadir di area lain dari permukaan sel (tanda panah).

Panah putih tebal menunjukkan gumpalan besar partikel virus di bawah membran plasma.

Perkembangan terbaru dalam imaging berkecepatan tinggi, yakni Bruker NanoWizard ULTRA SPEED 2 Atomic Force Microscopy.

Alat ini dapat melakukan scanning hingga 10 frame per detik dengan studi serapan dan pelepasan virus resolusi temporal tinggi, jauh di atas kecepatan yang terjadi di vivo.

Probing the mechanical properties of viruses

Kemampuan Atomic Force Microscopy untuk menerapkan beban yang tepat dalam kisaran pN hingga μN dengan resolusi spasial nanometer, menjadikannya alat yang sempurna untuk menyelidiki sifat mekanik virus.

Mode single-point atau spktroskopi pada kapsid virus tunggal dilengkapi dengan imaging simultan dan pemetaan sifat mekanik melalui Pemetaan Nanomekanik Kuantitatif PeakForce (PF-QNM) dengan mode Ql.

Pada figure 5 menunjukkan bagaimana spektroskopi single-force dapat digunakan untuk menyelidiki kekakuan kapsid HSV-1. Setelah memperoleh gambar Atomic Force Microscopy dari partikel virus, probe AFM dapat ditempatkan tepat di atas kapsid individu untuk pengukuran indentasi.

Selanjutnya, dari kapsid dengan bahan kimia yang melepaskan genom (misalnya guanidine hidroklorida, GuHCl) pengukuran in situ dari perubahan keakuan yang diinduksi secara kimiawi (Fig. 5 di bawah)

(Atas) Gaya 7nN menyebabkan kegagalan mekanis kapsid. Kurva linier (biru tua) diambil ketika kapsid masih utuh, putaran probing berikutnya (kurva merah) menyebabkan kegagalan mekanis kapsid.

(Bawah) Peneran GuHCl menginduksi pelepasan genom dan akibatnya menyebablan penurunan kekakuan kapsid (kurva biru muda diambil dari kapsid utuh berwarna hijau muda dari kapsid yang diberi GuHCl).

h3 hingga h8 mewakili nilai indentasi. Gambar diadopsi dengan izin dari J.Cell Sci.

Electrochemical-Atomic Force Microscopy imaging of redox-immuno-marked proteins on native potyviruses

Model SECM Bruker BioAFM dapat digunakan untuk penyelidikan arus elektrokimia pada skala nanometer secara bersamaan untuk imaging topografi AFM.

Tidak hanya itu, modul percobaan dapat dilakukan pada inverted optical microscopes (IOM) yang suhunya dapat diatur sesuai kebutuhan oleh spesimen yang diinginkan.

Gambar 5, menunjukkan contoh partikel virus selada mosaik individu (LMV) dan virus kentang A (PVA) yang dihiasi dengan antibodi redoks sedang diselidiki oleh teknik SECM berbasis mode Tapping.

Penandaan imun khusus menggunakan antibodi yang dihiasi dengan rantai redoks (ferrocenylated)-PEG, menjadikanpemetaan in situ dan distribusi protein pada partikel virus individu dan lokalisasi protein individu.

(A) Skema siklus redoks kepala ferrocene (Fc) ditanggung oleh antibodi Fc-PEGylated yang menghasilkan arus ujung. Secara bersamaan memperoleh gambar topografi (B) dan arus ujung kasar

(C) Media pencitraan: 10 mM pH 7,4 dapar fosfat. Diadaptasi dengan izin dari Komunitas Kimia Amerika.

Conclusion

Contoh tersebut hanya beberapa dari sekian contoh menonjol dari potensi Atomic Force Microscopy untuk mempelajari virus.

Berikutnya, contoh ini pula menunjukkan bahwa teknologi AFM modern tidak hanya dapat melakukan pencitraan topografi beresolusi tinggi tetapi juga karakterisasi mekanis pun elektrik lanjutan dari partikel virus dan siklus hidupnya.

Bruker terus berupaya memperluas kemampuan teknologi Atomic Force Microscopy dengan mengembangkan teknik baru yang mendukung para ilmuwan dalam penelitian Life Science sehingga dapat penemuan baru dan menarik di bidang virologi.